NC | 土壤微生物组的结构和功能揭示全球湿地N2O释放

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编译：林丽敏     校稿：朱琪

论文ID

原名：Structure and function of the soil microbiome underlying N₂O emissions from global wetlands

译名：土壤微生物组的结构和功能揭示全球湿地N₂O释放

第一/通讯作者：Mohammad Bahram

作者单位：

1 Institute of Ecology and Earth Sciences, University of Tartu

2 Department of Ecology, Swedish University of Agricultural Sciences

期刊：Nature communications

发表时间：2022

研究背景

N₂O是由微生物产生的能够消耗臭氧层的关键的温室气体，而湿地土壤是N₂O最大的释放源头。但N₂O释放的关键的微生物种类与过程尚未明晰。文章表明在干涸且温暖的湿地土壤中N₂O释放量更高，这与微生物群落的功能多样性相关。同时，文章证明虽然古菌的丰度远低于细菌，但硝化古菌却是全球湿地土壤N₂O释放的关键因子；持续的全球气候变暖以及加剧的环境变化可能促进硝化古菌活性，使湿地土壤成为更大的N₂O释放源。

尽管湿地土壤（包括潜育土壤和泥煤土壤）仅占全球8%的地表，然而湿地土壤是有机碳存储量最大的系统之一。微生物降解土壤中的C和N会导致温室气体（GHG）的大量释放，包括N₂O。N₂O是一类强效的温室气体，其温室效应潜力比CO₂高265倍，同时也是最重要的臭氧消耗物质。越来越多的湿地土壤的土地利用发生变化，例如植树造林、转变为农田用地，这些改变都需要进行排水，这一长期后果就是N₂O释放。为了降低湿地土壤的N₂O释放，我们需要深入了解塑造氮循环和N₂O动力学相关的微生物活动的生化路径以及重要的环境因子。

微生物过程，如传统的反硝化、硝化菌反硝化以及异化硝酸盐转化为氨氮，都会产生N₂O（主要在缺氧条件下实现）。而氨氧化是硝化过程的第一步，是一个好氧过程，主要由三类菌完成：标准的氨氧化菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）以及氨完全氧化菌（Comammox Nitrospira）。AOA不仅直接产生N₂O，也会产生反硝化反应的底物（亚硝氮）。然而对促进上述各项微生物反应、N₂O的产生与消耗过程的环境条件知之甚少。在许多土壤环境中，在促进反硝化以及N₂O释放方面，AOA可能起着未被探明的重要角色。

通过采用原位N₂O测量、测定全球645个湿地的土壤微生物的结构与潜在功能，作者评估了古菌、细菌以及真菌在氮循环以及N₂O释放中扮演的潜在角色。

研究地点与采样

本文的采样时间为2011年8月到2018年6月的植物生长期间；采样地点包括了全球六大洲29个地区包括三种气候类型：A（热带多雨）、C（温带）和D（北方）气候类型（基于Köppen分类）。气体和土壤样本是从公共区域或与当地社区和/或财产所有人的提前协议采集，根据法律规定，样品通过与各自国家的海关官员特别是出于科学目的的豁免从原产国运送至实验室。在各个地区的全方位环境条件下，我们建立了76个湿地土壤采样点，包括了不同植被（苔藓、莎草、草地、草本植物、树木和裸土）和土地利用类型（天然沼泽、沼泽和森林；农业耕地、干草田和牧场；泥炭开采区）（图1a）。研究采用四级土地利用强度指数来量化土地利用变化的影响：0-无农业用地（自然沼泽、沼泽或沼泽林）；1-适度放牧或割草（一年一次或更少）；2-密集放牧或割草（每年一次以上）；3-耕地（直接施肥或未施肥）。

在每一个采样地区，作者建立了1-4个采样站（共196个），相距15-500m，以最大限度地获取环境变化。每个采样站都配备了3-5个不透明PVC 65 L截锥采样器，间距为1.5-5m，以及一个观察井（多孔、直径50mm、包裹在土工布中的PP-HT管；长度为1m）。645个截锥采样器，采用静态试验箱法，使用PVC环（直径0.5m，安装在土壤中0.1m深处）测量N₂O通量。在气体取样之前，稳定3-12小时，以减少插入套环对通量的干扰影响。将腔室放置在套环顶部的充水环中。在1小时的试验过程中，每隔20分钟从试验箱顶部空间将气体取样到50mL玻璃瓶中。在3天内，每个地点至少进行三次采样。气体取样期间，从观察井记录地下水位高度。在10厘米和20厘米深处测量土壤温度。

气体取样后，从0-10cm深度的试验箱中收集150-200g的土壤样品，并运至爱沙尼亚塔尔图的实验室。将样品均质后分为子样品进行物理化学分析和DNA提取。用于化学分析的样品储存在4°C下，微生物样品储存在-20°C下。DNA提取工作由塔尔图大学环境微生物学实验室完成。在运输过程中，土壤样本维持在采集时的环境土壤温度中。

结果与讨论

01

全球N₂O排放量模式

研究数据表明更温暖的土壤和更剧烈的土地利用变化可能增强湿地土壤的N₂O释放。N₂O释放与最温暖月份的温度呈指数增长的关系。同时，N₂O释放与土地利用类型显著相关，最大值出现在裸露土壤，最小值出现在森林土壤。纬度越高，N₂O释放越低。与N₂O释放相反，潜在的N₂产量在温带气候中达到峰值，与土地利用强度呈负相关。在其他不同生态系统的研究中也发现N₂O释放增加与气温上升相关。

图1. 全球N₂O释放热点地区与在不同土地利用类型的硝化古菌的关系

02

全球N₂O排放量与微生物多样性和类别的关系

与N₂O释放越靠近赤道越增加相对应（图 1b），随着纬度降低，古菌的多样性显著增加。相反，中纬度地区的湿地土壤的细菌多样性却是最高的；而真菌多样性与纬度没有显著关系但在平均年气温为10-15℃的区域达到峰值。气候与土壤因子对湿地土壤微生物（包括古菌、细菌和真菌）多样性的影响最显著。古菌的多样性取决于土壤C/N比例；土壤pH是细菌最主要影响因素；而真菌多样性与环境因素关联性最弱。

基于16S和18S rRNA扩增得到的微生物物种结果发现，Proteobacteria，Acidobacteriota，以及Chloroflexi是丰度最好的微生物门类。然而这些微生物与N₂O释放相关性并不显著，而AOA的相对丰度（属于Thaumarchaeota门）与N₂O释放最为相关。基于宏基因组数据，所有真核和原核微生物中，Soil Crenarchaeotic Group (SCG)与N₂O释放的相关性最强。另外，基于长读长测序技术（PacBio）在>5个采样地点得到的620个古菌OTUs发现，11个OTUs（包括5个属于Nitrososphaerales目，为氨氧化古菌）与N₂O释放呈正相关。其中，N₂O排放量与最接近‘Candidatus Nitrosotenuis chungbukensis MY2’(r=0.488，p<0.001)和‘Candidatus Nitrosocosmicus oleophilus MY3’的OTUs相关性最显著。这两类古菌的纯培养物也证明产生N₂O。氨氧化古菌在未施肥或低氨氮环境的硝化过程中起着重要作用。

图2. SSU rRNA基因的相对丰度数据

03

宏基因组分析揭示全球N₂O排放量

为了研究导致N₂O释放的功能路径，文章采用宏基因组分析了直系同源基因组（OGs）集群。在所有潜在的N₂O释放相关的古菌的重点基因群中，古菌amoA基因(ENOG411114F)的相对丰度与N₂O释放的相关性最强（r=0.625, p<0.001；图3）。文章发现好氧氨氧化路径受制于Thaumarchaeota门的四个古菌属：Nitrososphaera、Nitrosocosmicus、Nitrosotenuis以及Nitrosarchaeum。土壤硝氮浓度也与古菌amoA基因丰度呈强相关性(r=0.551，p<0.001)。比较基因组学分析发现相对于细菌，古菌在氨氧化路径中富集更多。总体而言，本研究发现Thaumarchaeota对全球湿地土壤N₂O的释放起着潜在关键作用。然而涉及Thaumarchaeota古菌N₂O产生的路径与酶类型尚未明晰。

图3. 古菌以及古菌amoA基因与全球湿地土壤N₂O释放呈强正相关

04

驱动全球N₂O排放的功能基因

本研究采用定量qPCR的方法对氮循环中的主要基因进行绝对定量。古菌氨单加氧酶基因（archaeal amoA）和细菌氨单加氧酶基因（bacterial amoA）与N₂O释放呈强正相关。在低纬度地区，氨氧化古菌丰度相对于反硝化菌增加与N₂O释放增加（图1）相一致。古菌amoA的绝对丰度高于细菌amoA，说明在湿地土壤系统中古菌的硝化作用的重要性。

令人意外的是，氮循环涉及的其他主要基因并不能很好的解释N₂O释放。Comammox amoA基因与N₂O释放的相关性较弱，这可能是由于Comammox能适应低氨氮环境或者由于Comammox Nitrospira产N₂O的量相对较少。此外厌氧氨氧化菌（Anammox）和亚硝氮/硝氮相关的厌氧甲烷氧化菌（n-damo）的丰度与N₂O排放量无相关性。nosZ基因（编码氧化亚氮还原酶）的丰度与N₂O排放量呈正相关。N₂O产生的硝化基因（nirK和nirS）与N₂O排放量无相关性或者相关性弱。nir基因与nosZ基因（编码N₂O还原为N₂的酶）呈强相关性。这也解释了nir基因丰度高的土壤N₂O释放少。然而N₂产量与nosZ丰度并无显著相关性。此外，反硝化相关的基因由于物种不同差异大，且并非所有的反硝化菌都编码所有的这一系列基因。土壤pH和有机物浓度也可能影响反硝化作用产生N₂O。然而，反硝化菌相较于硝化菌有更丰富的代谢功能，可能利用不同的化合物作能源和呼吸作用，反映在它们较弱的环境相关性上。

接下来，作者将N₂O释放与参与氮循环的主要基因（基于qPCR的基因绝对定量）的多样性联系起来，发现N₂O释放的增加与参与氮循环功能基因多样性增加有关（图4c）。这一现象可能是由于氮相关过程之间的互补，尤其是反硝化和硝化过程均能产生N₂O。这一互补发生在干涸的湿地土壤，这类湿地土壤会经历不同的缺氧和好氧条件，硝化微生物产生的硝氮能够作为反硝化过程的底物。环境条件的变化取决于水位动态变化，多变的环境决定了生物多样性，进一步影响湿地土壤的N₂O排放。然而，作者发现土壤因子（C/N比和pH）以及气温对功能基因多样性的影响程度高于土壤水含量。在研究的功能基因中，古菌amoA的丰度与气温和C/N比相关性最强，氮循环基因多样性也是类似。与作者预期不符的是，微生物的物种多样性与N₂O的释放的相关性并不显著，这也与之前的研究不符。物种多样性与功能多样性的不同结果可能是由于在氮循环中微生物物种活性的功能性冗余。

图4. 氮循环基因作为主要因子解释全球湿地土壤N₂O释放

05

N₂O相关微生物群落的环境决定因素

文章进一步分析促进驱动N₂O释放的微生物物种与基因的环境影响因素。古菌amoA与年气温呈单峰曲线关系，峰值出现在20℃(r²_adj=0.255，p<0.001)。这与之前研究发现的AOA活性在温度更高的季节增加的规律一致。AOA/AOB的比值呈强正相关，意味着平均年气温与土壤温度之间呈强正相关，这也与相对高温有利于AOA的情况相符。这些结果说明偏高的土壤温度（>15℃）加上适宜的土壤湿度可能会通过促进AOA丰度的增加从而加剧N₂O释放。然而，仍需要验证这一情况如何通过AOA与AOB之间的相对平衡而得到补偿。

结论

本文分析发现全球N₂O排放取决于湿地土壤的微生物组的结构与功能以及气候条件。考虑到土壤湿度与温度的耦合影响，古菌对于干涸的湿地土壤的氮循环的贡献尤为重要。此外，古菌的丰度是氨氧化路径相关的重要因子揭示了全球湿地N₂O释放。本文补充了之前的研究（古菌是高山土壤和海洋N₂O释放的主要贡献者）。全球AOA的分布以及他们能适应低氧、低氨氮浓度是可能是他们能够在湿地土壤氮循环微生物群中起着关键作用的原因。

总而言之，本文发现硝化微生物对N₂O释放的贡献比先前预想的高，同时，氮循环相关的微生物多样性可以作为N₂O释放的综合预测因子。为了阐明全球N₂O释放的机理，我们需要了解不同栖息地类型的硝化过程和反硝化过程以及气候、植被、以及土地利用的影响。作者预测未来湿地土壤的排水以及气候变暖通过加剧古菌硝化作用从而增加反硝化的底物促进N₂O释放，将对湿地系统调节生态系统的功能形成负面影响。

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END

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课题组简介及招聘信息

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鞠峰，西湖大学研究员、博士生导师，环境微生物组与生物技术实验室负责人，浙江省海岸带环境与资源研究重点实验室副主任。目前担任中国工程院院刊Engineering、Front Microbiol、Eng Life Sci 等SCI期刊编委，以及Crit Rev Environ Sci Technol、J Environ Sci、Environ Sci Ecotechnol、The Innovation、iMeta等期刊青年编委。曾担任加拿大自然科学与工程理事会（NSERC）国际评审专家。2015年获香港大学工学博士学位，2015-2018年在瑞士联邦水科学与技术研究所 （EAWAG） 从事微生物生态与抗生素耐药方向博士后研究，2018年至今在西湖大学担任特聘研究员。曾获中国工程院院刊 Engineering“编委年度贡献奖”（2021）、中国生态学会“水云天微生物生态青年科技创新奖-特等奖”（2018）、香港科学会“青年科学家奖”（2016）、香港大学“杰出研究生奖”（2015）。近三年主持或参与国家级或省部级科研项目 4 项；目前参编中英文专著4本，在ISME J、Adv Sci、Microbiome 、Environ Sci & Technol、Water Res 等知名学术期刊发表论文50余篇，引用 3800余次。

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