JHM：芳环羟化双加氧酶数据库DARHD建立及相关引物评价

中文标题：DARHD：芳环羟化双加氧酶数据库及相关引物评价

英文标题：DARHD: a sequence database for aromatic ring-hydroxylating dioxygenase analysis and primer evaluation

Journal：Journal of Hazardous Materials

第一作者：厉舒祯

通讯作者：邓晔

Link:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304389422010202

图形摘要

背景

自然界中微生物对芳香族化合物的降解普遍存在。

芳环羟化双加氧酶(ARHDs)是微生物好氧降解的第一步及限速步骤。其中ARHDα亚基具有一定的保守性，已经作为标记基因来研究环境中芳香族化合物的降解潜力。

但是目前对于ARHDα亚基的多样性并不清楚，其用于环境样本的引物覆盖度未知。相关的功能基因数据库的更新也比较滞后。

因此我们构建了全新的ARHDα亚基数据库，评估了基因的多样性，并对已有的引物进行了系统评价。

方法及结果

1. 种子序列

从GeoChip 5.0, FunGene以及 UniProt等功能基因数据库收集了确认功能的氨基酸序列作为种子序列。

经过一系列的筛选和质控过程：序列必须为α亚基；具有明确的物种信息；序列长度大于200个氨基酸；

序列去冗余，保留序列相似度低于80%的序列及每个物种仅保留一条序列。

最终得到103条种子序列，涵盖了72个细菌属，34个基因名，17种不同的底物信息。对种子序列的分析初步表明α亚基具有广阔的分类学及系统发育多样性，且存在物种-基因和底物之间复杂的对应关系。

种子序列系统发育树

2. 数据库

种子序列经过比对之后构建隐马尔可夫模型（HMMs）,根据保守区域从GeneBank中下载具有保守区域的蛋白及核酸序列。根据E-value值及物种注释信息对序列进行可信度的划分。最终得到了DARHD。

数据库构建流程

DARHD共得到6367条高度可信的高质量序列，涵盖了407种细菌属，38种不同的底物类型。

其中22个属的序列超过了数据库的1%，最多的为Pseudomonas (13.25%)。

数据库中数量较高的物种及底物类型

通过对物种及底物之间关系的对应，再次印证了二者之间错综复杂的关系。

推测地理及环境因子；以及快速的进化和水平转移可能是导致基因发生变化的潜在原因。

物种和底物之间的对应关系

3. 引物评价

从62个不同的研究中收集了136对针对ARHDα亚基的引物，时间跨度从1993年到2017年。通过构建的DARHD对引物的覆盖度和特异性进行了in silico评价。此外，为了相互印证和增加可信度，我们还选取了一种纯菌及环境样本加以验证。

in silico评价结果表明，大部分引物的覆盖度都很低。尤其是在早期设计但目前还被广泛使用的引物，其用于设计的序列或者基因非常少，导致引物覆盖度非常低。而覆盖度较高的一些引物简并度又都很高。环境样本进一步验证了在用于不同样本时引物的适用性发生了变化。

因此，引物评价结果表明目前的引物用于复杂环境样本还存在很多的不足，实验时需要根据样本类型及研究目的进行特异性的引物设计。