Alkbh1

技术路线

实验内容

细胞：BMSCs脂肪分化1 μg/ml mouse optineurin (optn)-plasmid
染色：碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色、Red O 染色
qRT-PCR Western blot
斑点杂交(Dotblotting)
µCT analysis
免疫荧光：Alkbh1
组织化学和免疫组织化学
钙黄绿素双标记分析
ChIP assays：ChIP-qPCR assay

读图1：Alkbh1下调表达 in BMSCs during aging

A：来自GTEx的31个人正常组织中的Alkbh1表达模式
B：免疫荧光显示3个月大小鼠骨髓中Aklbh1（绿色）和巢蛋白（红色）的共定位。比例尺：50μm
C：免疫荧光显示培养的骨髓细胞中Aklbh1（绿色）和巢蛋白（红色）重叠。比例尺：100μm
D：微阵列数据中前500个deg的热图（GSE35955）
E和F：qRT-PCR和western blot分析年轻（3个月大）和老年（18个月大）小鼠（n=3）BMSCs中Alkbh1的表达

读图2：BMSCs中Alkbh1的缺失导致成骨分化受损和成脂分化增强

A：转基因小鼠PCR基因分型的代表性图像。
B和C：来自Prx1-Cre的BMSCs中Alkbh1表达的qRT-PCR（B）和western blot（C）分析；Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠（n=3）。
D：来自Prx1-Cre的BMSCs的ARS和ALP染色的代表性图像和量化；成骨分化下的Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠（n=3）。
E–H：qRT-PCR分析显示来自Prx1-Cre的BMSCs中Runx2、ALP、SP7和Bglap的转录减少；成骨分化下的Alkbh1fl/fl小鼠（n=3）。
I：Prx1-Cre骨髓间充质干细胞油红O染色的代表性图像和定量；Alkbh1fl/fl和Alkbh1fl/fl小鼠在脂肪分化下（n=3）。比例尺：50μm。
J和K：qRT-PCR分析显示来自Prx1-Cre的BMSCs中Pparg和Fabp4的转录增加；脂肪分化下的Alkbh1fl/fl小鼠（n=3）。

读图3：敲除BMSCs中的Alkbh1导致骨量减少和骨髓脂肪增加

A–E：3个月大和15个月大雄性小鼠（n=6–8）股骨的代表性μCT图像和定量分析。
F和G：HE染色的代表性图像（F）和股骨中脂肪细胞数量的定量（G）（n=5）。比例尺：100μm。
H和I：股骨中骨钙素阳性细胞的免疫组化染色（H）和定量分析（I）的代表性图像（n=5）。比例尺：50μm。 J和K：小梁骨钙黄绿素双标记的代表性图像（J）和MAR（K）的定量分析（n=5）。比例尺：20μm。

读图4：Alkbh1的缺失抑制optn的转录

A： 免疫荧光显示Alkbh1蛋白主要定位于小鼠骨髓间充质干细胞的细胞核内。DAPI为蓝色，Aklbh1为绿色，nestin为红色。比例尺：25μm。
B：斑点杂交分析显示，来自Prx1-Cre的BMSCs中基因组DNA 6mA水平增加；Alkbh1fl/fl小鼠。
C：与骨髓间充质干细胞分化相关的选定基因的热图（GSE30561）。
D： ChIP-seq图谱显示在optn启动子区域的Alkbh1-Flag-ChIP-seq富集。
E：标志的芯片qPCR。Alkbh1标志结合optn启动子区域（n=3）。
F：N6 mA的芯片qPCR。敲除Alkbh1可增加optn启动子区域的N6-mA富集（n=3）。
G和H：optn表达的qRT PCR（G）和western blot（H）分析（n=3）。

读图5：optn的过表达拯救了Alkbh1敲除BMSCs的异常谱系分配

A：optn和Alkbh1的Western blot分析。
B和C：ARS和ALP染色的代表性图像（B）和定量（C）（n=3）。
D–G：qRT-PCR分析成骨分化下BMSCs中Runx2、ALP、SP7和Bglap的转录（n=3）。
H：脂肪分化下骨髓间充质干细胞油红O染色的代表性图像和定量（n=3）。比例尺：50μm。
I和J：qRT-PCR分析脂肪分化下BMSCs中Pparg和Fabp4的转录（n=3）。

读图6：过表达Alkbh1可减弱老年小鼠的骨丢失和骨髓脂肪堆积

A和B：Alkbh1表达的qRT PCR（A）和western blot（B）分析（n=3）。
C–G：股骨远端的代表性μCT图像和定量分析（n=5）。
H和I：HE染色的代表性图像（H）和股骨中脂肪细胞数量的量化（I）（n=5）。比例尺：100μm。
J和K：股骨中骨钙素阳性细胞的免疫组化染色（J）和定量分析（K）的代表性图像（n=5）。比例尺：50μm。
L和M：小梁骨钙黄绿素双标记的代表性图像（L）和MAR（M）的定量分析（n=5）。