Worthington果胶酶的特性及测定方案

艾美捷Worthington 纯化果胶酶是一种多组分制剂，可高效解聚具有不同酯化程度的植物果胶。该产品含有大量的半纤维素酶、纤维素酶、果胶酯酶和木聚糖酶活性，与果胶裂解酶和多聚半乳糖醛酸酶协同作用消化植物细胞壁组织。当与 Worthington 纯化的纤维素酶一起使用时，已发现纯化的果胶酶在玉米、大豆、红甜菜、向日葵、番茄和柑橘等几种植物系统中非常成功地产生了高产量的活原生质体。一般来说，浓度范围为 0.1% 至 0.5% 的果胶酶（伴随着 0.5% 至 1.5% 的纤维素酶）在 24°C 至 37°C 下使用 1 至 16 小时会产生良好的效果。

主要的：  

果胶裂解酶 (4.2.2.10)

多聚半乳糖醛酸酶 (3.2.1.15)

半乳聚糖 1,4-α-半乳糖醛酸酶 (3.2.1.67)

次要的：

纤维素酶（内切纤维素酶（3.2.1.4）、外切纤维素酶（ 3.2.1.91） 、纤维二糖酶（3.2.1.21））

半纤维素酶 (3.1.1.73)

果胶酯酶 (3.1.1.11)

木聚糖酶 (3.2.1.8)

艾美捷Worthington 黑曲霉果胶酶的特性：

除了其高酶活性外，纯化的果胶酶还专门用于植物原生质体培养研究。使用定量测量D-半乳糖醛酸从多聚半乳糖醛酸中释放的方法测定酶。该方法基于使用盐酸新铜碱显色试剂测定法测定还原糖。当与 Worthington 纯化的纤维素酶一起使用时，已发现纯化的果胶酶可用于在几种植物系统（例如玉米、大豆、红甜菜、向日葵、番茄和柑橘）中产生良好产量的活原生质体。一般来说，浓度范围为 0.1% 至 0.5% 的果胶酶（伴随着 0.5% 至 1.5% 的纤维素酶）在 24°C 至 37°C 下使用 1 至 16 小时会产生良好的效果。

储存: 储存于 2-8°C。防潮。如果不一次使用整个瓶子，在到达时称重成一次性等分试样，并盖紧、干燥、冷藏保存。材料非常吸湿，如果暴露在湿气中会变得发粘且难以称重。

稳定性/储存： 防潮。如果不一次使用整个瓶子，在到达时称重成一次性等分试样，并在 2-8°C 下盖紧并干燥储存。材料非常吸湿，如果暴露在湿气中会变得发粘且难以称重。

单位定义：一个单位在 37°C、pH 5.0 下每分钟从聚半乳糖醛酸中释放 1µmole D-半乳糖醛酸。

技术说明：果胶酶具有J强的吸水性；储存干燥以防受潮。

艾美捷Worthington果胶酶的测定：

方法：在 37°C，pH 5.0 条件下，一个单位每分钟从聚半乳糖醛酸中释放 1 umole D-半乳糖醛酸。

试剂：

0.1 M 柠檬酸/磷酸盐缓冲液（测定缓冲液），pH 5.0

颜色试剂 A：将 40g 无水 Na 2 CO 3溶解 在 600 ml 试剂级 H 2 O 中。加入 16 g 甘氨酸并搅拌直至溶解。加入 0.450 gm CuSO 4 5H 2 O，搅拌至溶解。用试剂级 H 2 O 加至 1 升。

颜色试剂 B：将 1.2 g neocuprine - HCl 溶解在 1 升 H 2 O 级试剂中。在 4°C 下储存在棕色瓶中。

D-半乳糖醛酸标准品，1mg/ml

0.5% 聚半乳糖醛酸底物：

在热板上加热 500 ml 检测缓冲液。在加热和搅拌的同时，缓慢加入 2.5 gm 聚半乳糖醛酸。加热并搅拌直至溶解。它会有点粘稠和不透明。不要让溶液沸腾。如有必要，冷却并恢复音量。储存于 4°C。

酶：

每天化妆新鲜。将溶液放在冰上直至使用。在检测缓冲液中连续稀释至 0.01 mg/ml。

程序：

准备三个试管，每个试管含有 1 ml 缓冲液和 6 ml 底物（试剂空白）。准备三个试管，每个试管含有 6 ml 底物和 1 ml 0.1 mg/ml 的酶样品（测试）。准备三个试管，每个试管含有 6 ml 缓冲液和 1 ml 浓度为 0.1 mg/ml 的酶样品（样品空白）。

将试管在 37°C 水浴中孵育 60 分钟 ± 1 分钟。使用 10 μg 至 125 μg 的 D-半乳糖醛酸标准品将标准曲线管分装，一式三份。

试管孵育 60 分钟后，立即将支架放入冰水中以停止反应。从每管 100 μl 中分装到另一组管中（也在冰上）。向每个反应管和标准管中加入 2 ml Color Reagent A 和 2 ml Color Reagent B。倒置充分混合。将机架放入沸水浴中 13 分钟 ±1 分钟。冷却试管，然后加入 2ml H 2 O。倒置充分混合。使用一次性比色皿读取 A 450与水空白的吸光度。不要使用流通池；橙色附着在玻璃上。计算每组一式三份的平均吸光度。

计算：

绘制标准曲线：

 

 

计算变化率。曲线应该是线性的，直到 100 ug D-半乳糖醛酸，如果不是，用新鲜试剂重复曲线。