Worthington产气荚膜梭菌神经氨酸酶的特征及测定

神经氨酸酶（唾液酸酶）从多种糖蛋白中分离出 N-乙酰神经氨酸（唾液酸）。神经氨酸酶是在蛋白质化学和细胞生物学中研究糖蛋白的重要工具（Hatton等， 1973）。

艾美捷 Worthington 神经氨酸酶来源于产气荚膜梭菌。在 Cassidy等人的工作的基础上，该实验室开发了色谱纯化方法。（1965 年）。Wooley 和 Gommi (1966) 描述了这种神经氨酸酶在测量血清素受体的方法中的用途。它还用于确定组织中结合的 N-乙酰神经氨酸。

 

 

艾美捷Worthington产气荚膜梭菌神经氨酸酶的特征：

最佳 pH 值：5.0-5.1 (Burton 1963)。在 pH 4.0 或高于 pH 8.0 时几乎没有活性或没有活性。

等电点：5.1（Groome 和 Belyaven 1958）。

活化剂：无，与来自弧菌的神经氨酸酶相反，后者需要二价金属。

抑制剂：使用神经氨酸酶抑制剂作为可能的抗病毒和抗菌剂已显示出相当大的兴趣。（Khorlin等人1970；Haskell等人1970；和 Tute 1970）。

稳定剂：血清白蛋白，0.3 mg/ml (Cassidy et al . 1965)。

稳定性：纯化后的制剂在 4°C 下至少可以稳定保存两年（Cassidy et al . 1965）。

艾美捷Worthington神经氨酸酶的测定：

Method : 该测定基于牛颌下粘蛋白 (Worthington Code: MU) 释放的唾液酸 (NANA) 的测量。在特定条件下，在 37°C 和 pH 5.0 条件下，一个单位每分钟会从牛颌下粘蛋白中释放 1 微摩尔唾液酸。Ziegler和Hutchinson (1972)描述了用于确定神经氨酸酶的偶联酶测定。

试剂：

9 M 磷酸中的 0.2 M 偏高碘酸钠

0.5 M 硫酸钠

0.755 M 亚砷酸钠溶于 0.5 M 硫酸钠和 0.1 N H2SO4。通过将 25 gm 亚砷酸钠（分子量 129.91）溶解在 250 ml 0.5 M 硫酸钠中并加入 5 ml 5 N H2SO4 来制备。为了产生溶液，可能需要稍微加热。

2.5 N 盐酸

2.5 N HCl 中的 5% 磷钨酸

0.6% 两次结晶的硫代巴比妥酸在 0.5 M 硫酸钠中。通过将 4.5 克 2x 结晶硫代巴比妥酸溶解在 750 ml 0.5 M 硫酸钠中来制备。加热以产生溶液并使其冷却。将形成结晶沉淀。仅使用上清液进行检测。

0.1 M 乙酸，pH 5.0

1% 粘蛋白，pH 5.0。通过将 100 mgs Worthington 颌下粘蛋白（代码：MU）溶解在 9 ml 试剂级水中进行制备，用乙酸将 pH 值调节至 5.0，并稀释至最终体积为 10 ml。溶液在 pH 5.0 时会显得浑浊。

环己酮。注意：阅读产品标签以获取处理说明。

酶：

将酶以 1 mg/ml 溶解在试剂级水中。在使用前立即准备四种稀释液，范围从 0.1 mg/ml 到 0.005 mg/ml。

程序：

准备一个 37°C 的水浴。将分光光度计调整到 549 nm。进入编号管移液器如下：

粘蛋白 0.4 毫升

0.1 M 乙酸 0.5 毫升

每隔一段时间，加入 0.1 ml 的相应酶稀释液。包括 0.1 ml 水的空白代替酶。在 37°C 水浴中孵育 30 分钟。通过向每个试管中加入 1 ml 5% 磷钨酸，定时停止反应。离心 10 分钟。取出每个上清液的 0.5 ml 等分试样以干洗试管。向每个中加入 0.1 ml 0.2 M 偏高碘酸钠。在室温下静置 20 分钟，加入 1.0 ml 0.755 M 亚砷酸钠。摇动试管直到棕色消失，然后加入 3.0 ml 0.6% 硫代巴比妥酸。在沸水浴中加热 15 分钟，在冰浴中冷却 5 分钟，然后在每管中加入 4.6 ml 环己酮。通过涡旋提取环己酮层中的颜色。高速离心15分钟。549的有色环己酮层与试剂级水空白。

注意：样品的最终 A 549不应超过 0.5 个吸收单位。